Tanggal Praktikum :
29 Maret 2010
PENENTUAN KADAR PARACETAMOL DALAM SAMPEL
MENGGUNAKAN INSTRUMEN HPLC (High Performance Liquid Chromatography)
Tujuan
Memahami cara kerja instrument HPLC untuk analisis kuantitatif
Melakukan preparasi dengan tepat dan akurat, serta dapat mengikuti manual pengoperasian HPLC
Menentukan atau menghitung kadar paracetamol dalam sampel
Prinsip Dasar
Botani asal Rusia, Tswett adalah orang yang pertama kali dilaporkan melakukan pemisahan dengan cara kromatografi. Tahun 1903 dia sukses memisahkan pigmen-pigmen dalam daun menggunakan fasa diam yang berupa padatan polar. Pada tahun 1941 Martin dan Synge mendapatkan hadiah nobel untuk penelitian mereka yang mendeskripsikan kromatografi partisi cair-cair. Mereka menerapkan konsep plat-plat teoritis sebagai ukuran efisiensi dari kromatografi. Konsep ini mendasari untuk kromatografi gas-cair (GLC) dan kromatografi cairan kinerja tinggi (KCKT) atau disebut juga high-performance liquid chromatography (HPLC).
HPLC adalah perkembangan dari kromatografi kolom klasik dan merupakan temuan penting dalam teknik analisis. Kemajuan utama HPLC adalah pemisahan yang efisien. Pemisahan ini menggunakan partikel kecil dan pompa bertekanan tinggi.
Teori kromatografi
Kromatografi adalah metode analisis yang memiliki aplikasi luas untuk pemisahan, identifikasi dan penentuan komponen kimia dalam campuran kompleks. Teknik ini berdasarkan pada pemisahan komponen-komponen dalam campuran (zat terlarut) karena perbedaan laju migrasi komponen-komponen yang melalui fasa diam oleh fasa gerak. Factor-faktor yang terlibat dalam kromatografi antara lain :
Faktor kapasitas
Factor kapasitas, k’ , dari suatu senyawa menunjukkan perilaku retensi senyawa dalam kolom.
K’ = (Kd x Vs)/Vm = (Cs x Vm)/(Cm x Vs) = (tms-tm)/tm = ts/tm
Dimana Kd = koefisien distribusi
Vs = volume fasa diam
Vm = volume fasa gerak
Cs = konsentrasi zat terlarut dalam fasa diam
Cm = konsentrasi zat terlarut dalam fasa gerak
Harga K’ yang kecil menunjukkan bahwa senyawa tertahan lebih sebentar. Besar k’ menyiratkan pemisahan yang baik tapi memakan waktu analisis lebih lama dengan peak bordening dan menurunnya sensitivitas. Pemisahan ideal terjadi dengan factor kapasitas antara 1 dan 5.
Resolusi
Tujuan kromatografi adalah memisahkan komponen-komponen dalam campuran ke dalam band atau puncak-puncak saat mereka bermigrasi melalui kolom. Resolusi, R menyediakan ukuran kuantitatif kemampuan kolom untuk memisahkan dua analit. Pengukuran ini diperoleh dari waktu retensi dan lebar pita yang mudah diperoleh langsung dari kromatogram.
R = (tms2-tms1)/((w1+w2)/2) = (2△t)/(w1+w2)
tms1 dan tms2 = retensi bruto untuk masing-masing puncak 1 dan 2
w1 dan w2 = lebar puncak sepanjang baseline untuk puncak 1 dan 2
dua puncak yang diakui telah terpisah harus memiliki resolusi setidaknya o,5. Dua puncak terlihat telah terpisah sempurna jika R lebih besar dari 1,5. Resolusi dapat ditingkatkan dengan memperpanjang kolom tapi hal ini juga meningkatkan waktu analisis.
Efisiensi kolom
Efisiensi kolom biasanya dinyatakan secara matematika dengan istilah plat teori. Sebuah kolom kromatografi dibagi menjadi N plat teori. Sebuah kesetimbangan termodinamik analit-analit antara fasa gerak dan fasa diam terjadi dalam setiap plat.
N = L/H dimana L adalah panjang kolom packing (cm) dan H adalah plate height
Efisiensi kolom yang buruk menghasilkan band broadening.
Selektivitas kolom
Selektivitas kolom, α adalah ukuran pemisahan relative dua puncak dan didefinisikan sebagai rasio waktu retensi bersih dari dua puncak.
α = (tms2-tm)/(tms1-tm)
Koefisien distribusi atau partisi
Koefisien distribusi, Kd mengindikasikan distribusi analit-analit diantara resin dan eluen. Kd didefinisikan sebagai rasio konsentrasi molar solute pada fasa diam dan fasa gerak.
Kd = (massa campuran dalam resin (g)x volum resin(mL))/(massa resin kering (g)x volume eluen (mL)) = Cs/Cm
Cs dan Cm adalah konsentrasi molar solute dalam fasa diam dan fasa gerak.
Factor yang mempengaruhi Band Broadening
Berbagai factor mempengaruhi varians puncak. Penting untuk meminimalisis lebar puncak dan efisiensi dapat dimaksimalkan. Perluasan puncak dapat dinyatakan dalam plat ketinggian:
H = A + B/μ + Cstationary 𝝁 + Cmobile 𝝁
Difusi Eddy
Istilah A dalam persamaan di atas disebut difusi eddy. Istilah ini menggambarkan banyaknya jalur yang molekul-molekul solute dapat ikut di dalam packed column.
Difusi Longitudinal
Molekul dalam pita sampel cenderung untuk berdifusi keluar dari pita ini selama melalui kolom kromatografi. Proses ini dikenal sebagai difusi longitudinal dan merupakan istilah B dari persamaan di atas.
Transfer massa
Istilah C adalah transfer massa, yang merupakan pertukaran zat terlarut molekul antara fasa diam dan fasa gerak. Oleh karena itu, molekul berbeda menghasilkan jumlah yang bervariasi waktunya di fasa gerak dan diam, yang mengarah pada perluasan band.
Walaupun kromatografi gas digunakan secara luas, namun penggunaannya hanya terbatas pada sampel yang panasnya stabil dan mudah menguap. Sampel yang tidak mudah menguap seperti peptida dan karbohidrat, dapat dianalisis dengan gas kromatografi tetapi hanya terbatas penguapan mereka dengan proses derivate kimia yang sesuai. Karena alasan ini, berbagai macam teknik dikembangkan termasuk kromatografi cair.
Pada HPLC (High Performance Liquid Chromatography), suatu sampel cair atau sampel padat yang larut dalam pelarut yang sesuai, dibawa melalui kolom kromatografi dengan fasa gerak berupa cairan. Pemisahan ditentukan oleh zat terlarut atau interaksi fasa diam, termasuk adsorpsi cair-padat, partisi cair-cair, pertukaran ion dan eksklusi ukuran dan oleh zat terlarut atau interaksi fasa gerak. Berikut adalah diagram skematik dari HPLC.
Jenis-jenis HPLC
Ada banyak cara untuk mengklasifikasikan kromtografi kolom cair. Jika klasifikasi ini didasarkan pada sifat fasa diam dan proses pemisahan 3 jenis dapat ditentukan.
Dalam kromatografi adsorpsi fasa diam adalah adsorben seperti silica gel dan pemisahannya didasrakan pada pengulangan langkah adsorpsi-desopsi.
Dalam kromatografi pertukaran ion, fasa diam memiliki permukaan bermuatan pengion, muatan berlawanan dengan ion sampel. Teknik ini digunakan hamper secara eksklusif dengan ionic atau sampel ionizable. Semakin kuat muatan pada sampel, semakin kuat tertarik ke permukaan ion dengan demikian semakin lama waktu yang diperlukan untuk elut keluar dari kolom. Fasa gerak berupa cairan buffer, baik pH dan kekuatan ion digunakan untuk mengontrol waktu elution.
Dalam pengeluaran ukuran kromatografi kolom, diisi dengan material yang memiliki ukuran pori-pori yang tepat dan sampelnya hanya diputar atau disaring sesuai dengan ukuran molekul. Molekul yang lebih besar dengan cepat dicuci melalui kolom, yang lebih kecil menembus molekul berpori dari partikel dan kemudian elute. Untuk alasan historis, teknik ini juga disebut filtrasi gel atau kromatografi perembasan gel. Walaupun begitu fasa diam tidak terbatas pada sebuah gel.
Mekanisme retensi
Secara umum, HPLC adalah proses adsorspsi dinamis. Molekul analit sementara bergerak dan cenderung untuk berinteraksi dengan tempat pemisahan adsorpsi. Tergantung pada mode HPLC, berbeda jenis pada gaya adsorpsi yang mungkin termasuk ke dalam proses retensi:
Interaksi hidrofobik adalah yang utama dalam pemisahan fasa terbalik
Interaksi dipole-dipol di dominasi fasa normal
Interaksi ion bertanggung jawab atas retensi dalam pertukaran ion
Kolom HPLC
Sebuah HPLC biasanya mencakup dua kolom, yaitu kolom analisis untuk pemisahan dan kolom penjaga. Kolom penjaga diletakkan sebelum kolom analisis untuk mencegah dari kontaminasi.
Kolom Analisis
Merupakan kolom HPLC yang paling sering digunakan dan terbuat stainless steel dengan diameter internal antara 2,1 mm dan 4,6 mm. panjangnya berkisar antara 30 mm sampai 300 mm. kolom ini dikemas dengan partikel silica berpori berukuran 3-10 m yang memiliki bentuk tidak teratur atau bulat. Efisiensi kolom adalah 40.000-60.000 teori plat/m. Mikrokolom menggunakan lebih sedikit pelarut dan karena sampel yang dilarutkan lebih sedikit, maka menghasilkan sinyal yang lebih besar di detector.kolom ini terbuat dari kapiler leburan silica dengan diameter internal 44-200 m dan panjang hingga beberapa meter. Mikrokolom dikemas dengan partikel 3-5 m yang disusun dengan efisiensi kolom sampai sekitar 250.000 teori plat.
Kolom Penjaga
Ada dua masalah yang mempercepat kerusakan kolom analitis. Pertama, ikatan zat terlarut irreversible ke fasa diam menurukan kinerja kolom dengan menurunkan fasa diam yang tersedia. Kedua, ada partikel materi yang ikut tersuntik dengan sampel yang dapat menyumbat kolom analisis. Untuk meminimalkan masalah ini, sebuah kolom penjaga ditempatkan sebelum kolom analisis. Kolom penjaga biasanya mengandung partikel yang sama dengan fasa diam pada kolom analisis. Mempunyai panjang 7,5 mm dan lebih murah daripada kolom analisis. Kolom penjaga diganti secara teratur.
Fasa Diam
Dalam kromatografi cair-cair, fasa diam adalah cairan film yang dilapiskan pada material kemasan yang terdiri dari partikel silica berpori 3-10 m. fasa diam mungkin sebagian akan larut dalam fasa gerak. Untuk mencegah hilangnya fasa diam ini, maka fasa diam diikat secara kovalen pada partikel silica. Ikatan fasa diam diperoleh dengan mereaksikan partikel silica dengan organochlorosilane dengan bentukumu Si (CH3)2 RCl dimana R adalah alkil atau alkil yang tersubstitusi.
Untuk mencegah interaksi antara zat terlarut dengan gugus –SiOH, silica sering direaksikan dengan Si(CH3)3Cl. Sifat dari fasa diam ditentukan oleh sifat organosilane’s gugus alkil. Jika R adalah gugus fungsional polar, maka fasa diam akan polar. Contoh fasa diam polar, dimana R terdiri dari cyano (-C2H4CN), diol (-C3H6OCH2CHOHCH2OH), atau amino (-C3H6NH2). Karena fasa diam polar, fasa bergerak adalah nonpolar atau pelarut yang cukup polar. Kombinasi dari fasa diam polar dan fasa gerak non polar disebut kromatografi fasa normal. Dalam kromatografi fasa terbalik, sering ditemui dalam HPLC, fasa diam non-polar dan fasa gerak polar. Fasa diam non-polar paling umum menggunakan organochlorosilane dengan R adalah n-octyl (C8) atau n-octyldecyl (C18) rantai hidrokarbon.
Fasa Gerak
Urutan kelarutan zat terlarut dalam HPLC diatur oleh polaritas. Dalam fasa normal, pemisahan zat terlarut yang kurang proporsional menghabiskan waktu lebih cepat dan yang pertama keluar dari kolom. Waktu retensi dikontrol dengan memilih fasa gerak, dimana fasa gerak yang kurang polar memiliki waktu retensi yang lama. Contohnya, adanya pemisahan yang buruk terjadi karena zat terlarut yang terelusi terlalu cepat, lalu beralih ke fasa gerak yang kurang polar yang memakan waktu retensi yang lama dan lebih banyak pemisahan yang terjadi. Dalam urutan pemisahan, zat terlarut yang sangat polar lebih dahulu keluar. Kenaikan kepolaran dari fasa gerak mengakibatkan waktu retensi lebih lama, waktu retensi yang pendek diakibatkan oleh kekurangpolaran fasa gerak.
HPLC Plumbing
Yang terpenting dalam instrument HPLC adalah pelarut yang digunakan. Dengan mengontrol kepolaran dari fasa gerak memainkan peran penting dalam mengatur pemisahan kromatografi cair. Sebelum digunakan, fasa gerak pelarut harus diperlakukan sedemikian rupa untuk menghilangkan gas N2 dan O2 dan partikel kecil lainnya, seperti debu. Gas yang tidak terlarut tersebut sering menyebabkan terjadinya gelembung gas ketika fasa gerak masuk ke detector, mengakibatkan distorsi pada sinyal detector. Untuk itu dilakukan beberapa cara mencegah hal tersebut terjadi, dan yang paling umum dilakukan adalah penggunaan pompa vakum dengan gas inert. Contohnya He, yang mempunyai kelarutan rendah dalam fasa gerak. Sedangkan partikel-partikel yang dapat menyumbat kolom HPLC dibuang dengan cara disaring.
Pelarut fasa gerak ditarik dengan menggunakan pompa. Kebanyakan HPLC menggunakan pompa reciprocating yang terdiri dari sebuah piston yang gerakannya maju-mundur dan dapat mempertahankan peningkatan pengaliran fasa gerak dan adanya tekanan keluaran yang tinggi diperlukan untuk mendorong fasa gerak melewati kolom kromatografi.
Pengenalan sampel
Adanya tekanan yang tinggi dalam HPLC menyebabkan tidak mungkin menyuntikkan sampel dengan cara yang sama seperti pada kromatografi gas. Sampel dimasukkan dengan cara loop injector yaitu penyuntikkan sampel dalam kolom yang akan dibawa oleh fasa gerak.
Alat yang paling dulu ada dan paling mudah untuk memasukkan cuplikan adalah syringe. Syringe disuntikkan melalui septum (seal karet) dan untuk ini dirancang syringe yang tahan tekanan sampai 1500 psi.
Detektor untuk HPLC
Spectroscopic detectors
Yang paling popular dalam detector HPLC yaitu berdasarkan pengukuran spektroskopi, termasuk UV/Vis absorption dan fluoresensi. Detector ini mempunyai design sederhana, dimana panjang gelombang yang akan dianalisis dipilih dengan menggunakan filter yang yang tepat. Jika menggunakan detector UV/Vis, kromatogram yang dihasilkan adalah plot fungsi absorbansi dan waktu elusi.
Electrochemical detectors
Detector elektrokimia biasanya didasarkan pada daya hantar litrik (konduktometri) dan polarografi. Detector jenis konduktometri biasanya digunakan untuk mendeteksi solut-solut yang dapat mengalami reaksi redoks baik senyawa organic maupun anorganik.
HPLC biasanya digunakan untuk analisis kualitatif maupun kuantitatif dari lingkungan, farmasi, industri, forensic dan sampel produk konsumen.
Ketika dibandingkan dengan kromatografi gas, HPLC hanya berbeda dalam skala operasi, akurasi, presisi, sensitivitas, selektivitas, waktu, biaya dan kebutuhan alat. Volume injeksi HPLC lebih besar dari GC karena perbedaan kapasitas kolom, presisi HPLC lebih baik karena penggunaan loop injector. Karena HPLC tidak terbatas pada analit volatile, kisaran senyawa yang dapat dianalisis lebih besar daripada GC. Kolom kapiler GC memiliki lebih besar teoritical plates, yang menyediakan penyelesaian lebih baik untuk kompleks campuran.
(David Harvey :578-589)
Sistem Data
Tujuan utama dalam menggunakan system data elektronik adalah untuk meningkatkan akurasi dan analisis presisi, sekaligus mengurangi perhatian operator. Keuntungan dari prosesor kromatografi adalah :
pilihan otomatis, tambahan menjadi lebih mudah untuk diterapkan
analisis data yang kompleks menjadi lebih banyak
pengendalian otomatis oleh computer termasuk injector, pompa pengontrol gradient, pengumpul fraksi sampel.
Menghemat waktu dan usaha pada proses kromatografi.
Parasetamol
Struktur parasetamol :
Massa molar : 151,17 g/mol
Massa jenis : 1,263 g/cm3
Titik leleh : 168 ̊ C (334 F)
Kelarutan dalam air = 14 mg/mL (25 ̊ C)
Parasetamol tersedia dalam tablet , kapsul , suspensi cairan, supositoria , infus , dan intramuskular formulir. Dosis maksimum harian yang direkomendasikan, untuk orang dewasa, adalah 4000 mg. Dalam dosis yang direkomendasikan, parasetamol umumnya aman untuk anak-anak dan bayi, serta untuk orang dewasa.
(http://wikipedia.com)
me~~~~
BalasHapustesttt~~~~ chemiastry ^^
BalasHapus